La capacité de fixer des marqueurs fluorescents sur les anticorps à l’aide du FITC (fluorescéine isothiocyanate) a transformé de nombreux protocoles de recherche, notamment en cytométrie en flux, en microscopie à fluorescence, et en imagerie cellulaire. Les kits de marquage au FITC sont des outils pratiques permettant de modifier des anticorps pour des applications de fluorescence précises. Ce guide explore la chimie de conjugaison du FITC, les stratégies d’optimisation, les protocoles recommandés et les meilleures pratiques pour intégrer les anticorps marqués au FITC dans les essais en laboratoire sans compromettre la qualité du signal.
Le FITC est un colorant fluorescent vert qui réagit avec les groupes amines libres des protéines, en particulier les résidus de lysine, pour former des liaisons thiourées stables. Il est largement utilisé pour plusieurs raisons :
Fort pouvoir d’absorption à 488 nm (excitation)
Émission maximale autour de 519 nm (filtrage standard)
Bonne photostabilité dans les tampons biologiques
La chimie de marquage est détaillée dans les ressources comme les protocoles de bioconjugaison de la NCBI.
Un kit typique de marquage au FITC comprend :
Du FITC purifié (forme NHS-esters ou isothiocyanate)
Un tampon de conjugaison (souvent bicarbonate de sodium)
Des colonnes de filtration ou des filtres centrifuges
Éventuellement un tampon d’arrêt ou des stabilisants
Ces kits facilitent le processus tout en assurant la reproductibilité. Leur utilisation est documentée par des institutions comme l’Université de l’Iowa et le NIH Flow Cytometry Core.
L’anticorps doit être sans azide ni protéines porteuses
Concentration idéale : 1–10 mg/mL
Éviter le BSA ou la gélatine qui interfèrent avec la réaction
Voir les recommandations des installations de Harvard et de Yale.
Utilisez des tampons sans amines, tels que :
PBS (pH 7,2–7,4)
Bicarbonate de sodium (pH 8,5–9,0)
Évitez le Tris qui entre en compétition avec le FITC.
Consultez les protocoles du NIST pour des tampons validés.
Échange de tampon si l’anticorps est dans du Tris ou contient de l’azide.
Mélangez l’anticorps avec le colorant FITC selon un ratio molaire (ex. 1:10).
Incubez à température ambiante pendant 1 heure à l’obscurité.
Éliminez l’excès de colorant avec une colonne de désalinisation ou un filtre.
Calculez le ratio D/P (colorant/protéine) par spectrophotométrie à 495 et 280 nm.
Méthodologie décrite sur PubMed Central.
Ratio optimal : 3 à 7
Un excès de colorant peut altérer la liaison antigénique
Plus d’informations via les protocoles du CDC.
Réalisez la réaction à pH neutre ou légèrement alcalin
Utilisez des tampons filtrés et des anticorps purifiés
Voir les conseils de l’Université UC Davis.
Les anticorps marqués au FITC ciblent des marqueurs tels que :
CD4, CD8, CD19, CD45
Complexes majeurs d’histocompatibilité
Voir UCSF Flow Cytometry et NHLBI Flow Cytometry.
Le FITC-Annexine V détecte l’exposition de phosphatidylsérine
Peut être combiné avec PI ou 7-AAD
Protocoles sur le site du NCI.
Le FITC permet de visualiser :
Antigènes nucléaires
Protéines cytosquelettiques
Récepteurs membranaires
Voir Human Protein Atlas et NIH Microscopy.
Le FITC est compatible avec :
DAPI (bleu)
Texas Red (rouge)
Cy5 (infrarouge lointain)
Utilisé pour cartographier des compartiments cellulaires ou des complexes protéiques.
Guide de co-localisation via Stanford Imaging.
Conservez à 4 °C, à l’obscurité, dans du PBS avec 0,02 % d’azide
Utilisez des tubes ambrés
Évitez les cycles de congélation/décongélation
Voir Johns Hopkins Imaging Core pour des conseils.
| Problème | Cause | Solution |
|---|---|---|
| Signal faible | Ratio D/P trop bas | Recalculer le ratio molar |
| Bruit élevé | Colorant libre | Refaire la purification |
| Précipitation | Tampon inapproprié ou contaminant | Re-purifier l’anticorps |
| Photoblanchiment | Exposition à la lumière | Utiliser des agents antifading |
Plus de conseils via le Colorado State Flow Core.
L’utilisation des kits de marquage au FITC représente une solution économique et flexible pour la conjugaison d’anticorps dans les laboratoires étudiant l’analyse cellulaire, la détection de protéines, ou l’imagerie fluorescence. En suivant des stratégies validées — choix du tampon, ratio molar précis, purification adéquate —, les chercheurs peuvent obtenir des anticorps fluorescents fiables, compatibles avec des applications de routine.
Que ce soit en cytométrie multicolore, en microscopie immunofluorescente, ou dans les études fonctionnelles, les anticorps marqués au FITC restent un outil de référence. L’alignement avec les protocoles publiés par des institutions reconnues telles que le NIH, CDC, NCI, NCBI, UCSF, Stanford et Harvard garantit des résultats reproductibles et fiables.
